ประเภทของกล้องจุลทรรศน์เรืองแสง

เมื่อกล้องจุลทรรศน์ถูกประดิษฐ์ขึ้นเมื่อราวปี ค.ศ. 1600 นักปรัชญาธรรมชาติได้หันมามองโลกภายในโลก เมื่อ Antony van Leeuwenhoek ประดิษฐ์เลนส์ขนาดเล็กที่มีความโค้งสูงและตัวยึดกลไกสำหรับปรับมุมมอง เขาได้เปิดหน้าต่างสู่โลกแห่งแบคทีเรีย เซลล์เม็ดเลือด โปรโตซัว และโครงสร้างเซลล์ของพืชด้วยกล้องจุลทรรศน์ แต่ตลอดประวัติศาสตร์ของกล้องจุลทรรศน์ มีคำถามหนึ่งเสมอว่า สิ่งแปลกประหลาดเหล่านี้มองเห็นอะไรผ่านเลนส์? กล้องจุลทรรศน์เรืองแสงหมายถึงชุดของเทคนิคที่ลดความไม่แน่นอนนั้นให้เหลือน้อยที่สุด เพราะในกล้องจุลทรรศน์เรืองแสงเมื่อแสงส่องบนตัวอย่าง มันจะส่องแสงของตัวเองกลับมาทันที

Epifluorescence

กล้องจุลทรรศน์เรืองแสงที่พบบ่อยที่สุดคือการกำหนดค่า epifluorescence ในกล้องจุลทรรศน์แบบอีพิฟลูออเรสเซนซ์ แหล่งกำเนิดแสง ซึ่งปกติแล้วคือหลอดปรอทหรือซีนอน จะส่องผ่านฟิลเตอร์ที่เลือกช่วงความยาวคลื่นที่แคบ แสงที่กรองแล้วจะส่องไปที่ตัวอย่างผ่านเลนส์ใกล้วัตถุด้วยกล้องจุลทรรศน์ แสงที่เข้ามาจะถูกดูดซับโดยฟลูออโรฟอร์ - ฉลากโมเลกุลที่เปล่งแสงที่มีความยาวคลื่นยาวเมื่อดูดซับแสงที่มีความยาวคลื่นสั้นกว่า แสงจากฟลูออโรฟอร์พร้อมกับแสงที่กระจัดกระจายจากแหล่งกำเนิดแสงจะกลับเข้าสู่เลนส์ใกล้วัตถุและไปยังเครื่องตรวจจับหรือตา ระหว่างทาง ฟิลเตอร์อีกตัวหนึ่งจะปิดกั้นแสงส่องสว่าง ดังนั้นสิ่งที่เหลืออยู่ก็คือแสงจากหลอดฟลูออเรสเซนต์จากตัวอย่าง

คอนโฟคอล

กล้องจุลทรรศน์ epifluorescence รวบรวมแสงจากทุกที่ภายในขอบเขตการมองเห็นของกล้องจุลทรรศน์ แสงกระตุ้นบางส่วนจะถูกดูดกลืนก่อนระนาบโฟกัสของกล้องจุลทรรศน์ แสงบางส่วนอยู่ที่ระนาบโฟกัสและบางส่วนอยู่นอกระนาบโฟกัส เนื่องจากกล้องจุลทรรศน์เก็บแสงทั้งหมดนั้นไว้ ภาพจึงจะมีภาพแสงที่จุดโฟกัสที่คมชัด แต่จะมีแสงนอกโฟกัสจากบริเวณอื่นๆ ด้วย กล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลแก้ไขได้โดยการโฟกัสจุดเลเซอร์ในระนาบเดียวกับที่กล้องจุลทรรศน์ถูกโฟกัส จากนั้นรูเข็มจะไปที่ด้านหน้าเครื่องตรวจจับ ซึ่งจะปิดกั้นแสงทั้งหมดที่ไม่ได้มาจากการโฟกัสด้วยกล้องจุลทรรศน์ โดยการสแกนตัวอย่าง สามารถรับภาพสามมิติที่สะอาดของวัตถุได้

มัลติโฟตอน

ในกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอล การจัดตำแหน่งนั้นไวมาก หากจุดเลเซอร์ วัตถุประสงค์ของกล้องจุลทรรศน์ ออปติกการรวบรวม และรูเข็มปิดอยู่ แม้กระทั่งประสิทธิภาพการทำงานของกล้องจุลทรรศน์จะได้รับผลกระทบเพียงเล็กน้อย กล้องจุลทรรศน์แบบมัลติโฟตอนสามารถแก้ไขปัญหานี้ได้โดยใช้ความยาวคลื่นเลเซอร์ที่มีพลังเพียงครึ่งเดียวตามที่ต้องการเพื่อกระตุ้นฟลูออโรฟอร์ในตัวอย่าง วิธีเดียวที่ฟลูออโรฟอร์จะตื่นเต้นและเปล่งแสงฟลูออเรสเซนต์คือถ้าแสงเลเซอร์สว่างเพียงพอที่อนุภาคของแสงสองอนุภาค - โฟตอน - กระทบฟลูออโรฟอร์ในเวลาอันสั้น ซึ่งจะเกิดขึ้นก็ต่อเมื่อเลเซอร์ถูกโฟกัสไปที่จุดเล็กๆ เท่านั้น ดังนั้น ที่เดียวในตัวอย่างที่จะเปล่งแสงคือตำแหน่งที่เลเซอร์โฟกัส ซึ่งทำให้ภาพสวยและสะอาด เพราะไม่มีแสงพื้นหลังเพิ่มเติมให้กำจัด ซึ่งหมายความว่าไม่มีรูเข็มให้จัดแนว

การเรืองแสงสะท้อนภายในทั้งหมด (TIRF)

อีกวิธีหนึ่งในการได้ภาพที่สะอาดมากคือต้องแน่ใจว่าแสงกระตุ้นไม่ได้เข้าไปในตัวอย่างมากนัก ตัวอย่างเช่น หากหยดเซลล์ประสาทลงในสารละลายหยดหนึ่งบนสไลด์แก้ว เซลล์ประสาทบางส่วนจะเกาะติดกับพื้นผิวแก้ว ในกล้องจุลทรรศน์เรืองแสงสะท้อนภายในทั้งหมด (TIRF) แสงจะถูกส่งไปด้านข้างในสไลด์แก้ว ดังนั้นจึงไม่ได้ทำให้มันกลายเป็นสารละลายที่ยึดเซลล์ไว้ แต่แสงบางส่วนแทบจะไม่รั่วไหลเข้าไปในสารละลาย เพียงใกล้กับพื้นผิวของกระจกมาก ซึ่งหมายความว่าสถานที่แห่งเดียวที่จะเปล่งแสงจะอยู่ในบริเวณที่บางมากโดยเทียบกับพื้นผิวกระจก สำหรับบางอย่าง เช่น เซลล์ประสาท ซึ่งมีสิ่งที่น่าสนใจมากมายเกิดขึ้นบนพื้นผิวเซลล์ เทคนิคนี้จะมีประสิทธิภาพมาก

ความละเอียดสูง

กล้องจุลทรรศน์ทั้งหมด รวมถึงกล้องจุลทรรศน์เรืองแสง ถูกจำกัดโดยฟิสิกส์ที่ควบคุมการแพร่กระจายของแสง กฎพื้นฐานข้อหนึ่งคือจุดโฟกัสของแสงจะมีขนาดเล็กเท่านั้น และไม่เล็กกว่านั้น สำหรับแสงที่มองเห็นได้ ขนาดนั้นอยู่ที่ประมาณ 200 นาโนเมตร หรือ 2 แสนล้านส่วนเมตร แต่โมเลกุลเดี่ยวมีขนาดเพียงไม่กี่นาโนเมตร จึงมีคุณลักษณะที่น่าสนใจมากมายที่อยู่ต่ำกว่าขีดจำกัดขนาดนั้น เรียกว่าขีดจำกัดการเลี้ยวเบน นักวิทยาศาสตร์กำลังพัฒนาเทคนิค "ความละเอียดสูง" เพื่อหลบเลี่ยงขีดจำกัดนั้น ตัวอย่างเช่น กล้องจุลทรรศน์เรืองแสงแบบมีโครงสร้าง (SIM) และกล้องจุลทรรศน์ลดการปล่อยแสงกระตุ้น (STED) เป็นวิธีที่ใช้กล้องจุลทรรศน์เรืองแสงทั้งสองวิธีซึ่งจำกัดขนาดของจุดเปล่งแสงโดยการลดขนาดของจุดไฟกระตุ้น